克隆(clone,clon)一詞源于希臘文Klon,原意為樹(shù)木的枝條。在生物學(xué)中其名詞含義系指一個(gè)細(xì)胞或個(gè)體以無(wú)性繁殖的方式產(chǎn)生一群細(xì)胞或一群個(gè)體,在不發(fā)生突變的情況下,具有完全相同的遺傳性狀,常稱(chēng)無(wú)性繁殖(細(xì)胞)系;其動(dòng)詞(clone,cloned,cloning)含義指在生物體外用重組技術(shù)將特定基因插入載體分子中,即分子克隆技術(shù)。研究基因的第一步是分離它并獲得許多與它完全相同的拷貝。這稱(chēng)為“克隆”基因。一個(gè)基因被克隆的過(guò)程稱(chēng)為分子克隆。
分子克隆是指分離一個(gè)已知DNA序列,并以in vivo(活體內(nèi))方式獲得許多復(fù)制品的過(guò)程。這一復(fù)制過(guò)程經(jīng)常被用于增加并獲取DNA片段中的基因,但也可用來(lái)增加某些任意的DNA序列,如啟動(dòng)子、非編碼序列、化學(xué)合成的寡核苷酸或是隨機(jī)的DNA片斷。
PCR技術(shù):使DNA分子先解螺旋,然后以得到的單戀為模版進(jìn)行復(fù)制。
步驟:
1.DNA變性(90℃-96℃):雙鏈DNA模板在熱作用下, 氫鍵斷裂,形成單鏈DNA
2.退火(25℃-65℃):系統(tǒng)溫度降低,引物與DNA模板結(jié)合,形成局部雙鏈。
3.延伸(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性較好)的作用下,以dNTP為原料,從引物的5′端→3′端延伸,合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。
每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。
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